Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для…
Приказ Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 04.04.2019 № 169 "Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения"
Текст — по данным ИПС «Законодательство России». Проверено 22.10.2026 08:22. Скачать .doc · Печать
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
Москва
4 апреля 2019 г. № 169
Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения
Зарегистрирован Минюстом России 29 мая 2019 г.
Регистрационный № 54775
В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. № 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, № 39, ст. 4991; 2014, № 25, ст. 3317; 2017, № 28, ст. 4145; 2018, № 6, ст. 896; № 41, ст. 6260), приказываю:
Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения.
Министр Д.Н.Патрушев
УТВЕРЖДЕНА
приказом Минсельхоза России
от 4 апреля 2019 года № 169#❝
МЕТОДИКА
производства молекулярно-генетического исследования
генно-инженерно-модифицированных организмов,
используемых для производства лекарственных средств
для ветеринарного применения#❝
1. Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения (далее - исследование, ГМО соответственно).#❝
2. Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике.#❝
3. В рамках исследования осуществляется анализ представленных юридическим лицом, осуществляющим на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель), документов и данных:#❝
б) полного наименования, места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика (ИНН) заявителя;#❝
в) полного наименования и места нахождения юридического лица либо фамилии, имени, отчества (при наличии), места жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;#❝
д) сведений об исходном организме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии)), ссылка на использованные определители);#❝
е) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;#❝
ж) информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО (для депонированных штаммов ГМО) либо информации о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГМО; условиях культивирования: наименованиях питательных сред, рН среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГМО в нативной форме; о применяемом способе и условиях хранения штамма ГМО: в случае лиофилизации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения; о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа колонии, сохраняющего полезный или диагностический признак); о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГМО; о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГМО (в случае непредставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО);#❝
з) описания структуры, внесенной или удаленной генетической конструкции и места ее локализации, характеристик встроенных или измененных генов;#❝
и) информации о генетической модификации: описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположения рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включения в состав мобильных генетических элементов;#❝
л) описания методики, позволяющей идентифицировать ГМО, в том числе описания нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПНР);#❝
м) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проводится исследование (в случае, если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО);#❝
4. В рамках исследования осуществляются следующие испытания предоставленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:#❝
а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 1 приложения к настоящей Методике;#❝
в) подтверждение присутствия (отсутствия) маркерных и селективных генов в геноме ГМО, указанных в таблице № 2 приложения к настоящей Методике;#❝
г) полногеномное секвенирование ГМО, который содержится в продукции в жизнеспособном виде (в случае непредставления заявителем ГМО данных полногеномного секвенирования ГМО, представляющего собой плазмиду, вирус (бактериофаг), бактерию или одноклеточное простейшее, животное, гриб), проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 3 приложения к настоящей Методике.#❝
5. Полногеномное секвенирование ГМО проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 3 приложения к настоящей Методике.#❝
6. Результаты исследования оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:#❝
полное наименование и место нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;#❝
полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;#❝
сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;#❝
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО);#❝
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);#❝
описание представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;#❝
выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций, об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам;#❝
7. К заключению о результатах исследования должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых оно составлено, подписанные лицами, проводившими испытания.#❝
8. В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные настоящей Методикой, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента, пригодные для проведения исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования.#❝
Приложение
к Методике производства
молекулярно-генетического
исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства
лекарственных средств для
ветеринарного применения#❝
Таблица № 1. Критерии эффективности методики
идентификации ГМО#❝
N п/п | Характеристика | Описание характеристики | Критерий | Методы оценки критерия |
1 | Специфичность ПЦР | Способность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую нуклеиновую кислоту (далее - НК) | ПЦР-тест-система должна выявлять целевую НК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять НК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследований | Для оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую НК и не содержащие целевую НК |
2 | Чувствительность ПЦР | Наименьшее содержание копий целевой НК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР-методики, в первую очередь зависит от свойств используемых праймеров и зондов | Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой НК, например, плазмидной, в одной ПЦР | Проводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной НК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором НК воспроизводимо выявляется (в двух повторах) |
3 | Эффективность ПЦР | Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации | Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6) | Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной НК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. Строят график зависимости Ct от логарифма концентрации НК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: Е = [10(-1/slope)]-1 В идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3,32) |
4 | Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD) | Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод | Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1% | Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО-ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР-методики. Определяют минимальное содержание ГМО-ингредиента в тотальной НК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах) |
5 | Предел количественного определения (LOQ) | Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью | Для методик ГМО предел должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) для методик ГМО не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал | Исследуют 10 повторов 0,1% ГМО-стандарта по ПЦР-методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения |
6 | Аналитическая область (dynamic range) | Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности. Для ГМО-методик обычно приемлем диапазон 0,1% - 5% | Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы) | Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала |
7 | Линейность | Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2- коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов | R2 - коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98% | Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5,0% калибровочные ГМО-стандарты по ПЦР-методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2) |
8 | Правильность | Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное | Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике | Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5,0% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР-методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца |
При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов.#❝
Таблица № 2. Основные маркерные и селективные гены, являющиеся
составляющими частями генно-инженерных конструкций#❝
Мишень | Описание |
| Ген LacZ | Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1 ТОРО, pVIK112, pBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цвет |
| Ген gfp | Ген зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся метки |
| Ген amp | Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, рЕТ, pCR2.1 ТОРО) |
| Ген Km | Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212) |
| Ген tetO | Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322) |
| F1 ori | Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO) |
| Транспозон Tn7L | Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp) |
| Ген ermC | Кодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные векторы |
| Ген cat | Кодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные векторы |
| R6K ori | Ориджин репликации плазмид (pVIK112) |
Таблица № 3. Критерии эффективности методики
полногеномного секвенирования#❝
Этап анализа | Характеристика | Описание характеристики | Критерий |
| Подготовка библиотеки для | Концентрация геномной ДНК | Не менее 0,2 нг/мкл | |
| секвенирования | Размер фрагментов ДНК | Распределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретически | Распределение в диапазоне 250 - 1000 п.н. Максимум распределения 300 - 500 п.н. |
| Проведение массового параллельного секвенирования | Распределение качества идентификации нуклеотидов | Q= -10log10p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотида | Q > 20, то есть вероятность ошибки не более 0,01 |
| Среднее качество прочтения | Q > 25 | ||
| Служебные последовательности | Наличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтении | Должны отсутствовать | |
| Покрытие чтения | Число чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности генома | Не менее десятикратного покрытия | |
| Представленность нуклеотидов в каждом цикле | Максимальное отклонение между А и Т или G и С | Не более 20% в любой позиции | |
| GC-состав на прочтение | Сумма отклонений от ожидаемого распределения | Не более 30% прочтений |
Документы того же органа рядом по дате
- О внесении изменений в Порядок определения нормативных затрат на выполнение государственных работ федеральными государственными бюджетными учреждениям — Приказ Минсельхоза России от 04.04.2019 № 173
- Об установлении срока представления в Министерство сельского хозяйства Российской Федерации выписки из закона субъекта Российской Федерации о бюджете — Приказ Минсельхоза России от 04.04.2019 № 166
- Об установлении срока представления в Министерство сельского хозяйства Российской Федерации выписки из закона субъекта Российской Федерации о бюджете — Приказ Минсельхоза России от 04.04.2019 № 165
- Об утверждении форм документов об использовании средств бюджетов субъектов Российской Федерации, предусмотренных приложениями №№ 7 - 9 к Государственн — Приказ Минсельхоза России от 04.04.2019 № 167
- О признании утратившим силу приказа Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 13 февраля 2008 г. № 43 "Об установлении и упразднении ка — Приказ Минсельхоза России от 09.04.2019 № 179
- О внесении изменений в Перечень подконтрольных товаров, подлежащих сопровождению ветеринарными сопроводительными документами, утвержденный приказом Ми — Приказ Минсельхоза России от 15.04.2019 № 193
- Об утверждении Перечня подконтрольных товаров, на которые могут проводить оформление ветеринарных сопроводительных документов аттестованные специалист — Приказ Минсельхоза России от 15.04.2019 № 194
- О внесении изменений в Перечень продукции животного происхождения, на которую уполномоченные лица организаций, являющихся производителями подконтрольн — Приказ Минсельхоза России от 15.04.2019 № 195